铁死亡的概念在2012年由Dixon等首次提出，是一类铁依赖性的以脂质过氧化和膜损伤为特征的细胞死亡形式^[1]。自噬是一种进化上保守的细胞器和大分子降解的机制。在高度环境依赖性的方式中，自噬可以介导对各种致病因子的细胞保护，但也可以通过释放溶酶体水解酶或选择性破坏抗细胞死亡蛋白来促进细胞死亡。最近在Autophagy上发表了一篇关于铜离子可以促进GPX4自噬降解的文章，强调了铜离子在驱动铁死亡发生发展中发挥了重要作用。作者认为这对于搞清GPX4的作用机制以及通过外加或螯合铜离子进而诱导或抵抗铁死亡有着重要作用。

一、研究背景：让我们以一张图来认识一下神秘的铁死亡。

图片来源：Chen et al . Cell Death and Differentiation （2022） （PMID: 35075250）

铁死亡有SLC7A11-GSH-GPX4信号轴（System Xc-/GpX4途径）：首先通过胱氨酸/谷氨酸逆向转运体将胱氨酸移入细胞内，谷氨酸移至细胞外，进入胞内的胱氨酸转变成半胱氨酸，接着合成谷胱甘肽（GSH），进而合成谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），参与抗氧化代谢过程，抵抗铁死亡。GPX4通过清除磷脂氢过氧化物在阻断铁死亡中起主要作用，是非常重要的蛋白质分子^[2]。

铁死亡被认为是研究自噬依赖性细胞死亡的模型。例如，铁自噬，一种选择性自噬，通过受体NCOA4 (核受体共激活因子4)介导的铁蛋白降解促进铁积累和随后的铁死亡。

二、研究思路和实验方法

1、铜离子螯合剂可以抑制铁死亡。

为了测定额外添加Cu₂⁺是否可以导致铁死亡，该研究通过对胰腺导管腺癌( PDAC )细胞的培养、细胞活性测定、细胞死亡测定、细胞荧光测定等实验技术验证了加入Cu₂⁺确实可以使细胞活性降低和细胞死亡增加，而且加入Cu₂⁺螯合剂后可以逆转该现象。

图1. 铜螯合剂抑制铁死亡

2、铜通过促进GPX4的自噬降解来放大铁死亡。

   由于Cu₂⁺确实可以引发铁死亡，那么将继续探究Cu₂⁺是通过什么机制通路来引发的铁死亡。由于细胞内GPX4水平与铁死亡敏感性密切相关，那么可以先通过蛋白印迹分析（Western blotting）鉴定一下GPX4蛋白水平是否变化。结果表明Cu₂⁺螯合剂可以使erastin诱导的GPX4蛋白下调，而Cu₂⁺则使其上调。同时，GPX4mRNA水平不受影响，而Cu₂⁺与erastin(以下简称Cu₂⁺ -erastin)合用则可以诱导GPX4泛素化，提示Cu₂⁺可能促进GPX4蛋白的降解。既往研究表明铁死亡中GPX4蛋白降解可通过蛋白酶体和自噬途径介导，然而药理学抑制自噬(用氯喹)可以阻碍Cu₂⁺ - erastin触发的GPX4蛋白降解，而抑制蛋白酶体(用硼替佐米)不可以。因此，作者猜想自噬可能参与了GPX4蛋白的降解。

图2. 铜通过促进GPX4的自噬降解来放大铁死亡

3、TAX1BP1（Tax1结合蛋白1）作为自噬受体参与GPX4的降解。

该研究又通过高分子量复合物检测以及RNA干扰和基因转染、免疫荧光检测等手段证明了Cu₂⁺可以通过增加GPX4自噬来增强erastin诱导铁死亡效应。为了进一步探究自噬与Cu₂⁺介导的铁死亡之间的关系，通过自噬流检测、Western blotting等方法证明了只有Cu₂⁺和erastin联合处理才可以显著激活自噬。之后通过免疫共沉淀实验发现了TAX1BP1是GPX4蛋白降解的关键自噬受体，Cu₂⁺ -erastin选择性地增加了GPX4与TAX1BP1的结合。

图3. 在铁死亡中TAX1BP1对GPX4降解至关重要

4、铜诱导的GPX4聚集依赖于GPX4的半胱氨酸残基。

有研究发现GPX4有2个表面可接近的半胱氨酸残基C107和C148，本研究通过定点突变将这些半胱氨酸残基替换为丝氨酸残基，发现C107和C148都是Cu₂⁺诱导GPX4聚集响应Cu₂⁺ - erastin所必需的。

图4. 铁死亡过程中铜促进GPX4聚集

5、铜增强了IKE（咪唑酮erastin）在体内的抗癌活性。

作者接下来检测了Cu₂⁺在体内是否增强铁死亡敏感性。用具有高代谢稳定性的erastin类似物咪唑酮erastin ( IKE )单独或与铜联合治疗人PDAC肿瘤的免疫缺陷小鼠。结果与体外实验一致，铜和IKE联合处理增加了移植瘤中的自噬。这些结果证实铜在体内促进癌细胞的铁死亡。

图5. 铜促进PANC - 1移植瘤裸鼠的铁死亡

6、铜螯合剂对铁死亡诱导的小鼠急性胰腺炎具有保护作用。

由于铁死亡是组织损伤引起的无菌性炎症的治疗靶点^[3]，所以作者也评估了铜在急性胰腺炎中的作用，这种疾病与过度的铁死亡密切相关。通过组织病理学检查，铜螯合剂减轻了L -精氨酸诱导的小鼠急性胰腺炎中腺泡细胞的死亡。与之相一致的是，铜螯合剂降低胰腺脂质过氧化、TFRC表达和炎症相关的铁积累。最重要的是，铜螯合剂给药阻止了胰腺GPX4表达的下调。这些数据表明铜有助于铁死亡诱导的急性胰腺炎。

图6. 铜螯合剂抑制小鼠铁死亡相关急性胰腺炎

三、结论

本研究发现了一种新的Cu₂⁺促铁死亡效应，即Cu₂⁺与GPX4蛋白表面暴露的特定半胱氨酸残基（C107 和 C148）结合并随后发生TAX1BP1依赖的自噬降解。这个发现可能为通过给予额外的Cu₂⁺来放大癌细胞理想的铁死亡，以及通过外加Cu₂⁺螯合抑制组织损伤性铁死亡提供潜在的治疗策略。

图片来源：Qian Xue et al . Autophagy（2023） （PMID: 36622894）

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36622894/

参考文献

[1] Dixon S J, Lemberg K M, Lamprecht M R, et.al. Ferroptosis: An Iron-Dependent Form of Non-Apoptotic Cell Death[J]. Cell, 2012, 149(5): 1060–1072.

[2] Lv J, Hou B, Song J, et.al. The Relationship Between Ferroptosis and Diseases[J]. Journal of Multidisciplinary Healthcare, 2022, 15: 2261–2275.

[3] Chen X, Kang R, Kroemer G, et al. Ferroptosis in infection, inflammation, and immunity. J Exp Med. 2021;218(6):e20210518.